藏红花素诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡及其作用机制

编辑:藏红花   日期:2009-11-02   575次浏览

藏红花素诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡及其作用机制
Effect and mechanism of HeLa cell apoptosis induced by crocin

 

出处:中华肿瘤防治杂志2009年10月第16卷第19期

作者:龚青、石丁波、蔡卫斌、杨中汉、谭维格、廖彩韵、彭超、刘畅、高国全、杨霞(中山大学中山医学院生物化学教研室 广东广州 510080)

目的:研究藏红花素对HeLa细胞的促凋亡作用和机制。

方法:设置0、0.2、0.4及0.8mmol/L 4个浓度梯度,MTT法分析不同浓度藏红花素对HeLa细胞增殖的影响;设置空白阴性对照及秋水仙素(10μg/L)阳性对照,向HeLa细胞培养物分别加入0.4和0.8mmol/L 的藏红花素,培养48h后用PI/Annexin V双染法分析其凋亡情况;1.6mmol/L 藏红花素作用于HeLa细胞72 h后,蛋白质印迹法检测Caspase-3的切割。结果:MTT实验分析显示,在0、0.2、0.4及0.8mmol/L 浓度下HeLa细胞存活率分别为1、0.964、0.796和0.586。藏红花素显著地抑制HeLa细胞生长,P<0.05;各浓度组间均差异有统计学意义,P<0.05。PI/Annexin V双染法、流式细胞仪检测显示,阴性对照组、10μg/L秋水仙素阳性对照组、0.4 及0.8mmol/L藏红花素处理组的细胞凋亡率分别为3.64%、15.99%、4.86%和9.28%,藏红花素促进HeLa细胞凋亡。蛋白质印迹法检测显示,藏红花素促进HeLa 细胞Caspase-3切割。

结论:藏红花素可明显地抑制HeLa细胞生长,并通过增加HeLa细胞Caspase-3切割促进其凋亡。

 

藏红花(Crocus sativas L.)是鸢尾科番红花属球根类草本植物,自古便是活血化瘀的良药。最新研究发现,藏红花还具有广谱抗癌活性,对白血病、卵巢癌、结肠癌、膀胱癌、横纹肌肉瘤、乳头肉瘤、扁平细胞瘤和软组织肉瘤等都具有较强的抑制作用,而且毒性较小。藏红花素(crocin)是藏红花最主要的一种色素,对多种癌细胞均有明显抑制作用,且与其他常用抗癌药物配合使用,可降低这些药物的毒副反应,改善疗效。目前对于藏红花素抑癌机制的研究表明,其有多种可能的作用通路,其中细胞凋亡路径得到了较多的研究支持。本研究旨在对藏红花素促HeLa细胞凋亡的作用进行研究,并初步探讨其诱导细胞凋亡的机制。

 

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

藏红花素和MTT购自美国Sigma公司,20mg藏红花素加12.5mg EDTA溶于4mL三蒸水,配成浓度为50mmol/L的母液,储存于4℃;RPMI1640培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司。Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit购自Bender Medsystens公司(凯基生物)。Caspase-3抗体购自Sant公司。

1.2 细胞系

HeLa细胞株可连续传代,将细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中,长满后0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.3 主要仪器

包括超净工作台、二氧化碳培养箱和HITACHI分光光度仪。

1.4 MTT法

取对数生长期的HeLa细胞,进行细胞计数,用细胞培养液调整细胞密度为2×104 个/mL 接种到12孔平板,每孔为2 mL,将平板置于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养,细胞贴壁后,吸出上清,加入含藏红花素的无血清培养液2mL,使得HeLa细胞藏红花素的浓度为0、0.2、0.4和0.8mmol/L,待检样品继续培养48 h。在实验终止前4 h加MTT(5 g/L)200μL/孔,继续孵育4h,吸出上清液,每孔加入1mL DMSO,摇匀,待Formazan溶解后,分光光度计在570nm处测OD值。实验中每份样品设3个复孔。用各个浓度的OD吸收值平均值除以对照组的OD吸收值,得出细胞存活曲线。

1.5 PI/Annexin V双染法

将对数生长期的细胞用含有10% 胎牛血清的RPMI1640培养液重悬,调整细胞浓度加入6孔培养板中继续培养,当细胞达到60%~70%融合时加入以无血清培养液配制的浓度为0.4和0.8mm/L 的藏红花素,阴性对照组为等量无血清培养液,阳性对照组为秋水仙素(10μg/L)。培养箱中继续培养48h后,0.25%胰蛋白酶消化制成细胞悬液,进行PI/Annexin V双染,流式细胞仪测定凋亡指数,进而分析确定藏红花素对HeLa细胞的凋亡作用。

1.6 蛋白质印迹法

SDS细胞裂解液收集药物处理24h的HeLa细胞,冰上超声1min,煮沸10min,10000r/min(r=10.3cm)离心15min,取上清液,行蛋白定量分析,然后进行SDS-PAGE电泳,再将其转移到PVDF膜上,脱脂牛奶封闭1h,加入1:1000 稀释的兔抗人切割Caspase-3抗体,4℃孵育过夜,再加入1:1000稀释的羊抗兔IgG 抗体,室温孵育2h,ECL显色,曝光。

1.7 统计学方法

所有数据用x±s表示,通过SPSS11.0 软件完成。采用方差分析,并用最小有意义差异狋检验(Least significant difference-t,LSD-t)进行均数间的多重比较,检验水准α=0.05。

 

2 结果

2.1 藏红花素对HeLa细胞增殖的抑制作用

在0.4 mmol/L 的浓度下,藏红花素处理组与对照组细胞相比呈现下降趋势(P<0.05),且其抑制作用表现为浓度依赖性(图1)。各组HeLa细胞生存率间差异有统计学意义,P<0.05。

 

图1 藏红花素对HeLa细胞生存率的影响 ※vs空白对照组,P<0.05;※※vs空白对照组,P<0.01

 

2.2 藏红花素对HeLa细胞凋亡的诱导作用

用藏红花素处理过的HeLa细胞收缩,细胞质减少,胞质出现空泡状区域,并出现核固缩(图2)。流式细胞仪检测证实,藏红花具有诱导HeLa细胞凋亡的作用(图3)。阴性对照组凋亡率为3.64%,10μg/L秋水仙素阳性对照组为15.99%,0.4mmol/L 藏红花素处理组为4.86%,0.8 mmol/L 藏红花素处理组为9.28%。结果表明,藏红花素具有诱导HeLa细胞凋亡的作用。

2.3 藏红花素对HeLa细胞Caspase-3激活的促进作用

0.4、0.8mmol/L 藏红花素作用HeLa细胞24h后,蛋白质印迹法检测Caspase-3切割条带的变化,藏红花素能促进HeLa 细胞Caspase-3 蛋白的切割(图4)。提示藏红花素诱导HeLa 细胞凋亡过程中Caspase-3被激活。

 

图2 藏红花素诱导HeLa细胞凋亡(×400) A:正常HeLa细胞;B:藏红花素处理的HeLa细胞;C:秋水仙素处理的HeLa细胞

 

图3 藏红花素诱导HeLa细胞凋亡 1:空白对照;2:0.4mmol/L藏红花素处理组;3:0.8mmol/L 藏红花素处理组;4:10μg/L秋水仙素阳性对照组

 

图4 藏红花素对HeLa细胞Caspase-3的激活作用 1:对照;2:0.4mmol/L藏红花素作用HeLa细胞24h后,Caspase-3切割条带的变化;3:0.8mmol/L 藏红花素作用HeLa 细胞24 h后,Caspase-3切割条带的变化

 

3 讨论

藏红花广泛分布于伊朗、西班牙、法国以及希腊等地,印度、日本也有栽培,经印度传入我国西藏,因此称为藏红花。近年来,传统中药的多靶点作用机制、较少不良反应等优点表现出诱人的应用前景,筛选出高效低毒的抗肿瘤中药是研究热点之一。

藏红花的有效成分主要包括产生苦味的物质以及多种色素,而后者对藏红花的疗效有着更为重要的意义。藏红花素是藏红花最主要的一种色素,由藏红花酸(crocetin)糖基化形成,是极其少见的水溶性类胡萝卜素。其特殊的水溶性及其对癌细胞强有力的抑制作用,使其成为了藏红花色素中更有望应用于癌症治疗的成分。用藏红花素处理过的HeLa细胞收缩,细胞质减少,胞质出现空泡状区域,并出现核固缩,这些都是藏红花素引起HeLa细胞凋亡的形态学证据,与文献报道相符。本研究通过MTT法和PI/Annexin双染法等方法证实了这一凋亡作用的存在。然而藏红花素诱导HeLa细胞凋亡的信号通路尚不明确。

研究证实,藏红花素对多种癌细胞均有明显抑制作用,且在与其他常用抗癌药物配合治疗过程中,可降低抗癌药顺铂等的毒副反应,改善疗效。目前对于藏红花素抑癌机制的研究表明,其有多种可能的作用通路,其中细胞凋亡路径得到了较多的研究支持。我们对藏红花素促HeLa细胞凋亡的作用进行了研究,并初步探讨其诱导细胞凋亡的机制。

Caspase-3是CPP32亚家族成员之一,是新近予以关注的Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一,它被合成后通常以非活化的酶原形式存在于细胞质中,在多种凋亡信号刺激下经蛋白水解作用被激活成活化形式,可对多种蛋白底物进行降解,从而在细胞凋亡过程中起关键作用,被认为是整个凋亡级联反应的一个关键调节点。本研究证实,藏红花素能促进HeLa细胞Caspase-3蛋白的切割,提示藏红花素诱导HeLa细胞凋亡过程中Caspase-3被激活。

本研究对藏红花素诱导HeLa细胞凋亡的机制进行了初步研究,该途径上游通路还有待进一步研究。

标签:藏红花 藏红花素 抗癌 癌症 肿瘤 宫颈癌

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